Struktur- und Aktivitäts-Untersuchung von peptidbasierten Modellen der NiSOD

Die Untersuchung von Radikalen in biochemischen Systemen bildet ein gemeinsames Forschungsinteresse der physikalischen Chemie und Biochemie. Die Superoxid-Radikal-Anionen sind ein unvermeidbares Nebenprodukt der aeroben Atmung, die kontinuierlich von den Zellen aerober Organismen produziert werden.[6] Des Weiteren ist die NAD(P)H-Oxidase ein Hauptproduzent von radikalischen Superoxidanionen[7] die Mikroorganismen abzutöten[8], indem sie NADPH als Substrat bindet und zwei Elektronen freisetzt. Diese beiden Elektronen werden durch FAD und zwei Hämgruppen auf die gegenüberliegende Seite der Membran transportiert und reduzieren dort Sauerstoffmoleküle zu Superoxid-Radikal-Anionen.
Die Entstehung und Wirkung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) wie z.B. Wasserstoffperoxid, Hydroxylradikale oder Superoxid-Radikal-Anionen wird intensiv erforscht und konnte schon mit einigen Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Sie sind in der Lage mit verschiedenen Biomolekülen wie DNA, Proteinen und Lipiden in ihrer Umgebung zu reagieren/interagieren und diese irreversibel zu schädigen. Weiterhin besitzen die reaktiven Sauerstoffspezies eine regulatorische Funktion in diversen physiologischen Prozessen, wie z.B. als Botenstoff zur Regulation der Signaltransduktionswege oder sie beeinflussen die Proliferation und das Wachstum von Zellen.
Der Schutzmechanismus der Superoxiddismutasen (SODs) ermöglicht das Leben unter aeroben Bedingungen und ist daher von großem wissenschaftlichem Interesse. Die Klasse der Superoxiddismutasen enthält drei verschiedene Unterklassen. Die NiSOD stellt eine Sonderform dar, denn in vielen Enzymen besteht das aktive Zentrum aus Aminosäuren, die weit entfernt voneinander in der Aminosäuresequenz liegen, aber sich aufgrund der übergeordneten Struktur in räumlicher Nähe befinden. Im Falle der NiSOD besteht das aktive Zentrum aus den ersten Nterminalen Aminosäuren, dem sogenannten Nickelhaken, die mittels Peptidsynthese leicht zugänglich sind, sodass das aktive Zentrum durch niedermolekulare Peptide imitiert werden kann. Die Synthese und Charakterisierung dieser Modellpeptide sind zentraler Bestandteil dieser Dissertation.
In den letzten Jahren gab es einige Veröffentlichungen bezüglich der Struktur und Aktivität diverser NiSOD-Modellpeptide, die teilweise widersprüchlich sind. Unter anderem werden unterschiedliche Verhaltensweisen von Peptiden in Lösung beschrieben, insbesondere in Bezug auf die Wechselwirkung der Peptide mit Nickel.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, diese Widersprüche der vorangegangenen Studien bezüglich der NiSOD-Modellpeptide zu untersuchen/klären. Zentraler Teil dieser Arbeit sollen Aktivitätsuntersuchungen der verschiedenen NiSOD-Modellpeptide mittels Stopped-Flow-Kinetik Messungen sein, sowie der Nachweis eines möglichen paramagnetischen Zustands des Nickels in den Peptiden mittels Kernspinresonanz-Spektroskopie (NMR) und Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (ESR).
Im Folgenden soll der Aufbau der vorliegenden Dissertation kurz erläutert werden. Im ersten Kapitel wird eine Einführung in die Thematik der Superoxiddismutasen gegeben. Dabei werden sowohl die Eigenschaften der Modellpeptide als auch die des zugehörigen Enzyms dargestellt, sowie eine kurze Einleitung in die NMR-Spektroskopie und in die Festphasenpeptidsynthese gegeben. Des Weiteren wird die Verwendung eines Peptidbindungs-Surrogats für cis- und trans-Konformation beschrieben und dessen Synthese erläutert.
Im Anschluss wird die Zielstellung dieser Dissertation vorgestellt, die resultierenden Ergebnisse zusammengefasst und anschließend diskutiert. Der Abschnitt mit den Ergebnissen und der zugehörigen Diskussion bildet den Hauptteil dieser Arbeit. Zunächst werden das Phänomen der Linienverbreiterung der NMR-Signale von Modellpeptiden in Gegenwart von Nickel beschrieben und mögliche Ursachen erläutert. Neben der beobachteten Linienverbreiterung der Protonensignale wurden longitudinale Relaxationszeiten für einzelne Protonensignale bei unterschiedlichen Nickelkonzentrationen in verschiedenen NiSOD-Modellpeptiden bestimmt. Die Synthese von Peptidbindungsmimetika sowie deren zentraler Baustein, ein disubstituiertes [1,2,3]-Triazol, bilden das nächste Unterkapitel. Im Vergleich zur nativen NiSOD besitzen die NiSOD-Modellpeptide im Allgemeinen keine cis- sondern eine trans-Konformation zwischen Leu4 und Pro5, sodass die „natürliche Variante“ mittels Peptidomimetika imitiert werden soll. Die Untersuchung der katalytischen Aktivität verschiedener Modellpeptide mittels Stopped-Flow-Kinetik Messungen soll Aufschluss über den Einfluss der Länge des Peptids, die Wichtigkeit einzelner Aminosäuren sowie die Auswirkung der Peptidomimetika auf die katalytische Aktivität liefern. Der Ausblick über zukünftige Experimente bezüglich des Paramagnetismus schließt den Teil dieser Arbeit ab und ermöglicht gute Ansatzpunkte für anschließende Arbeiten.
Im Experimentalteil werden die verwendeten Methoden und die durchgeführten Experimente beschrieben. Das Hauptaugenmerk liegt hierbei auf der Synthese der Modellpeptide sowie der Herstellung der Triazolbausteine für die Peptidomimetika.